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                    发论文利器之——CRISPR/Cas9文库筛选技术

                      CRISPR/Cas9技术凭借着设计简便、操作容易、效率高成为目前应用最广泛的基因编辑技术在2019年的国自然中标项目中,涉及CRISPR/Cas9的相关研究的中标项目共有32项,总资助金额为1204万元,占CRISPR总项目的一半以上,可以说表现也是相当亮眼了。

                      今年4月份《Nature》上发表文章,利用CRISPR文库高通量地在324种细胞中针对18,009个基因进行筛选研究,发现了1459种癌症生存相关的基因,并通过后续的深度分析和挖掘,罗列出最有希望成为药物靶标的基因,为癌症治疗药物的研究提供了方向。

                    CRISPR/Cas9文库筛选技术服务

                      相比与RNAi文库技术,CRISPR技术能够彻底破坏基因的功能,且脱靶性低于RNAi。CRISPR的技术既可以用于Loss-of-Function (如CRISPR KO,CRISPRi),又可以用于Gain-of-Function(如CRISPRa)的筛选研究,功能更加强大。

                      CRISPR/Cas9文库筛选技术

                      利用CRISPR/Cas9技术建立哺乳动物全基因组突变库或者与某类功能相关的基因突变体库,通过功能性筛选和富集以及随后的PCR扩增和深度测序分析,发掘与筛选表型相关的基因,称为CRISPR/Cas9文库筛选。

                      CRISPR/Cas9文库筛选应用方向

                      一、药物靶点确定与验证

                      CRISPR/Cas9筛选技术可以应用于药物靶点筛选中,通过大规模筛选技术,可以系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因,从而为疾病治疗提供相关数据。

                      比如这篇发表在Science上的文章,研究人员利用CRISPR/Cas9文库对人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选,最终发现NF2、CUL3等4个基因参与了黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。

                    CRISPR/Cas9文库筛选应用方向


                      二、基因环路上下游调控机制分析

                      CRISPR/Cas9文库筛选技术对于基因组中的调控元件也同样有效,利用这种方法可以对基因环路上下游调控机制进行分析。

                      比如这篇发布在Nature biotechnology上的文章,科研人员对癌症细胞中关键的转录因子p53和ERα的增强子元件的685个基因位点进行筛查,共鉴定出3个增强元件与ERα的相关;3个增强元件与p53功能相关联的3个增强子,其中2个增强元件与p53完全结合才能激活细胞衰老过程。

                    基因环路上下游调控机制分析


                      
                    三、Long noncoding RNA作用机制分析

                      CRISPR/Cas9文库的建立可以实现基因组的大规模筛选,比如为了对非编码基因的功能进行验证,下面这篇发布在Nature biotechnology上的文章,提出构建了psgRNAs文库的方法,这种成对的sgRNA可在同一基因中造成两处断裂,形成大片段缺失,从而影响表型变化,成为研究非编码基因的重要方法。使用慢病毒psgRNA文库,对人源肝癌细胞系Huh7.5OC进行基因组的700个lncRNA和另外5种癌症细胞进行敲除实验,最终筛选到51个lncRNA基因能够促进或者抑制肿瘤的生长。

                    基因环路上下游调控机制分析


                      
                    实验流程

                      CRISPR/Cas9文库筛选主要步骤如下图:

                    CRISPR/Cas9文库筛选服务实验流程


                      现在许多实验室,公司及临床项目已经开始对CRISPR/Cas9技术进行应用,比如:利用其进行信号通路相关基因的寻找,药物靶点筛选,药物原发性研究以及基因治疗等。

                      而你还在为找不到新的研究靶点烦恼吗?还在茫茫高通量测序数据海中捞针?

                      那就赶紧来试试巴菲尔的CRISPR/Cas 9文库高通量筛选技术——

                      1,快速准确的找到与某种表型相关的基因;

                      2,全基因组水平筛选,利于发现新靶点;

                      3,假阳性率较低,靶点命中率高;

                      4,应用范围广。


                      巴菲尔crispr/cas9文库筛选服务可以完成精准sgRNA序列的设计并精确人工合成,在基因敲除成功后,对测序结果进行基因表达谱分析、染色体DNA拷贝数统计等,最终实现从sgRNA设计、合成到功能分析的一体化服务。

                      巴菲尔crispr/cas9文库筛选整个服务流程是这样的:

                      一、你提供科研方向;

                      二、项目评估(是否具有创新性、是否适合使用文库筛选、以及适合何种文库);

                      三、开展预实验(目的细胞感染预实验、文库准备);

                      四、CRISPR/Cas9文库筛?。?/span>

                          1)包装CRISPR/Cas9文库慢病毒;

                          2)目的细胞大规模感染CRISPR/Cas9文库慢病毒;

                          3)加药筛选CRISPR/Cas9文库混合稳转细胞;

                          4)根据需求表型分选阳性细胞(如肿瘤耐药、克隆形成、转移等);

                          5)抽提基因组进行sgRNA扩增,NGS高通量测序;

                          6)数据分析,帮助客户选择候选靶标基因。

                      五、候选基因功能验证。

                      总之,不管是发论文还是国自然基因项目,CRISPR/Cas9文库筛选,你都值得拥有!

                      温馨提醒:

                      巴菲尔生物现有标准化的GeCKO v2 human library和SAM human library两种全基因组文库,除了可以为您提供全基因组范围内的大规模筛选服务。此外,巴菲尔生物还可根据客户课题特定的信号通路定制需求,进行个性化sgRNA定制,为您提供多样化的CRISPR/Cas9文库筛选服务。

                      参考文献:

                      1. Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7

                      2. Korkmaz, G., et al., Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016. 34(2): p. 192-8.

                      3. Zhu, S., et al., Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol, 2016.34(12): p. 1279-1286.





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