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                  实验指南

                  EXPERIMENT GUIDE
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                    入门必看:免疫共沉淀实验原理及详细步骤


                      研究蛋白之间相互作用必不可少的实验是免疫共沉淀(CoIP),常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分,因其具有可信度高的优点,在现在基础医学研究中广泛应用,本文将为您详解CoIP的实验原理和操作步骤,实验刚入门的同学必看哦。

                      一、实验目的

                      1)检测两种目标蛋白是否在体内相互作用;

                      2)找到与目标蛋白在体内存在相互作用的新蛋白。

                      运用这项技术,说不定你会有新的发现哦!

                      二、实验原理

                      CoIP是利用抗原蛋白和抗体的特异性结合、以及“Protein?A/G"特异性地结合抗体(免疫球蛋白)FC段的现象开发出来的方法。

                      目前多用Protein?A/G预先结合在Argarose?Beads上,使之与含有抗原蛋白的溶液(如细胞裂解液)及抗体(诱饵蛋白X抗体)反应后,Beads上的Prorein?A/G就能通过抗体吸附诱饵蛋白X,诱饵蛋白X通过与靶蛋白Y相互作用将其从细胞裂解液中分离出来,从而达到免疫共沉淀的目的。

                      如果还是不懂,看图就知道啦!

                    免疫共沉淀实验原理

                      三、实验材料

                      细胞、RIPA缓冲液(RIPA buffer)、偶联有Protein A/G的免疫磁珠(Protein A/G Beads)、诱饵蛋白X与靶蛋白Y的抗体、IgG对照抗体、移液枪、4度冰箱以及低温离心机等。

                      四、实验步骤(不同实验室略有差异)

                      1) 制备细胞裂解液:收集4x107细胞,用PBS洗涤后,加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂),充分混匀,冰上裂解30 min;4℃,12000 rpm离心10 min,收集上清液。

                      2) 免疫共沉淀:在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads,4℃翻转混合孵育1 h进行预清除,离心后取0.5 ml上清液,加入3 μg诱饵蛋白X抗体,另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG抗体作为对照,4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads,4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次,每次5 min。

                      3) Western Blot分析或MS质谱分析:沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer,煮沸10 min后离心取上清,用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析,以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析,以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。

                    免疫共沉淀实验步骤


                      五、实验心得体会

                      你可能做了很多Co-IP实验,经常遇到的问题是检测不到与诱饵蛋白X相互作用的靶蛋白Y,或者检测得到的信号太弱。你是否也遇到过呢?别急,小编贴心总结来了!

                      出现以上问题的原因可能有:

                      1)裂解液中的去垢剂过于剧烈;

                      2)蛋白与蛋白之间的相互作用太弱或者不稳定。

                      通常的解决办法如下:

                      1)降低去垢剂浓度或者更换去垢剂种类(SDS>Trition>NP40>Digitonin>CHAPS);

                      2)选择亲和力高的抗体以捕获更多的诱饵蛋白X从而捕获更多的相互作用蛋白;

                      3)通过细胞转染过表达的方式提高诱饵蛋白X的含量;

                      4)加入化学交联剂,增强诱饵蛋白X与相互作用蛋白的结合;

                      5)选择诱饵蛋白X或者相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验。

                      怎么样,你学会了吗?其实要做好免疫共沉淀实验需要你大量的经验积累,但是,如果你没时间做实验,并且还急着发论文该怎么办?

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